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鹽酸水蘇堿對小鼠乳腺炎的防治效果研究

來源:安徽農業大學 作者:張夢迪
發布于:2021-03-16 共4802字

  摘  要

  
  乳房炎是導致牛奶質量和產量大幅下降的原因,給奶業造成了嚴重的經濟損失。近幾十年來,非甾體抗炎藥(NSAIDs)和抗生素作為常規藥物治療乳房炎。然而,抗生素耐藥性已經成為主要的公共威脅之一。中藥相比抗生素來說具有天然、安全、副作用小等特點,可減少藥物殘留和耐受現象的出現。已有報道稱中藥提取物鹽酸水蘇堿具有抗炎抗氧化等活性,然而其對乳腺炎是否具有保護作用還尚未見到報道。因此本研究以鹽酸水蘇堿為研究對象,進行了急性毒性試驗和體外抑菌試驗,并通過構建LPS誘發的小鼠乳腺炎模型來評價其對乳腺炎的防治效果,為其進一步開發利用提供數據參考。


鹽酸水蘇堿對小鼠乳腺炎的防治效果研究
 

  
  本研究采用小鼠急性毒性實驗方法,探討鹽酸水蘇堿小鼠腹腔給藥的安全性,進行鹽酸水蘇堿對小鼠腹腔注射給藥的半數致死量(LD50)測定,連續觀察7 d。同時,采用瓊脂稀釋法檢測最小抑菌濃度(MIC)研究了鹽酸水蘇堿對乳腺炎常見病原體大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果。建立LPS誘發的小鼠乳腺炎模型,觀察其大體解剖學變化,通過HE染色方法檢測乳腺組織的病理組織學變化,利用試劑盒檢測乳腺組織中MPO活性以及氧化應激指標T-SOD、GSH、MDA、NO的水平,利用酶聯免疫吸附測定(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒檢測血清炎細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白水平。
  
  安全性結果顯示,鹽酸水蘇堿的LD50劑量為1565.442 mg/kg,其95%可信區間為1440.781~1711.356 mg/kg,存活小鼠解剖觀察心臟、肝臟、腎臟、脾、腸道等無無明顯病理變化。體外抑菌試驗結果表明鹽酸水蘇堿對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC均為10 mg/kg。鹽酸水蘇堿對小鼠乳腺炎保護作用試驗結果顯示,鹽酸水蘇堿改善了乳腺炎造成的乳腺組織充血壞死以及乳汁蓄積狀況,使腺泡壁變薄,炎性浸潤減少,降低了MPO活性及促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達水平,同時顯著升高了T-SOD、GSH含量,降低了MDA和NO的含量。
  
  綜上所述,鹽酸水蘇堿有一定毒性并具有抑菌活性,能夠通過降低促炎因子水平、提高抗氧化能力來發揮對小鼠乳腺炎的保護作用。
  
  關鍵詞:     鹽酸水蘇堿;急性毒性;抑菌;乳腺炎;抗炎;抗氧化。
  

  ABSTRACT

  
  Mastitis is the cause of significant decline in milk quality and production, and has brought serious  economic  loss  to  the  dairy  industry.  In  recent  decades,  non-steroidal  anti-inflammatory drugs (NSAIDs) and antibiotics have been used for the treatment of mastitis as conventional drug therapy. However, antibiotic resistance has become one of the major public  health  threats.  Compared  with  antibiotics,  traditional  Chinese  medicine  has  the features like natural, safe, less side effects, etc., which can reduce the occurrence of drug residue and tolerance. It has been reported that stachydrine hydrochloride, the extract of traditional Chinese medicine, has anti-inflammatory and anti-oxidant activities, but whether it has a protective effect on mastitis has not been reported. Therefore, in this experiment, stachydrine hydrochloride was used as the research object to study its safety and antibacterial effect through toxicological test and in vitro bacteriostasis test, and to explore its protective effect on mastitis in mice by constructing a mouse mastitis model induced by LPS, in order to  provide  data  reference  for  the  further  development  and  utilization  of  stachydrine hydrochloride.
  
  In this study, the acute toxicity test method of mice was used to explore the safety of intraperitoneal administration of stachyine hydrochloride in mice, and the median lethal dose (LD50) was determined after 7 consecutive days. The minimum inhibitory concentration (MIC)  was  tested  by  agar  dilution  method  to  study  the  antibacterial  effect  of  stachyine hydrochloride  on  Escherichia  coli  and  Staphylococcus  aureus,  common  pathogens  of mastitis. A model of LPS-induced mouse mastitis was established to observe its general anatomical changes. Besides the histopathological changes of breast tissue was observed by HE staining method, the MPO activity and levels of oxidative stress indicators T-SOD, GSH, MDA and NO in breast tissue were detected, and the levels of serum inflammatory cytokines TNF-α, IL-1β and IL-6 were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits.
  
  Results of the acute toxicity test showed that the LD50 dose of stachyine hydrochloride was 15654.42 mg/kg, and its 95% confidence interval was 1440.781 ~ 1711.356 mg/kg. Surviving  mice  were  dissected  to  observe  heart,  liver,  kidney,  spleen,  intestine  and  no obvious  pathological  changes  was  observed.  The  results  of  bacteriostasis  tests  in  vitro showed  that  the  MIC  of  stachyine  hydrochloride  against  Escherichia  coli  and Staphylococcus  aureus  were  both  10  mg/kg. The  test  results  of  the  protective  effect  of stachylamine hydrochloride on mastitis in mice showed that stachylamine hydrochloride improved the congestion and necrosis of breast tissue and milk accumulation caused by  mastitis, thinned the acinar wall, reduced the inflammatory infiltration, the MPO activity, and the expression levels of pro-inflammatory factors IL-1β, IL-6 and TNF-α, significantly increased the levels of T-SOD and GSH, and reduced the levels of MDA and NO.
  
  In summary, stachyine hydrochloride has some toxicity and has bacteriostatic activity. It can play a protective role in mastitis  mice by reducing the level of pro-inflammatory factors and improving antioxidant capacity.
  
  Keywords:     stachydrine  hydrochloride;  acute  toxicity;  bacteriostatic;  mastitis;  anti-inflammatory; oxidation resistance。
  

  文獻綜述
 

  
  1、奶牛乳腺炎的研究進展。

  
  奶牛因病原微生物入侵、機械損傷和物理化學等刺激而導致乳房實質和間質發生的炎性變化稱為奶牛乳腺炎,其特點是感染部位的免疫細胞募集增加了體細胞計數(SCC),斷裂的乳腺上皮細胞(MEC)緊密連接增加了牛奶中的鈉含量[1],產奶量減少,全世界每年因乳腺炎導致的損失高達幾百億美元,已被認為是奶業最嚴重、最昂貴的疾病之一。由于過多的細菌刺激引起的乳腺炎有多種形式[2],從急性臨床性乳腺炎到慢性亞臨床性乳腺炎。臨床型乳房炎會導致乳腺腫脹、發紅和發熱,并伴有血管擴張,對患畜來說通常是痛苦的,而隱性乳房炎通常沒有癥狀,但最終仍會導致產奶量減少。對于具有明顯臨床癥狀的臨床型乳腺炎較容易診斷,可及早給出治療,而隱性乳腺炎由于缺乏典型病癥,較難診斷,需要實驗室診斷來分離和鑒定所涉及的病原體,而患病奶牛哺乳期甚至一生都會感染或威脅生命。雖然有的奶牛仍然可以產奶,但牛奶的品質及產量均受到影響,作為食源性產品的牛奶,產品產量及質量與人們的生活和身體健康息息相關,并且巨大的經濟損失也嚴重限制了養殖業的發展,其中78%的經濟損失是由于牛奶產量減少,另外8%的經濟損失來源于治療費用,剩余14%的經濟損失來源于撲殺[3]。在乳腺炎被人類認識的上百年來,科學家們一直不斷研究,我國認識該病時間較晚,雖有一定的研究但并沒有完整徹底解決該病發生與治療。現今我國仍然以抗生素為主要治療原則,而抗生素所引起的細菌耐藥性是生產過程及往后治療的一大障礙,牛奶中會存留抗生素殘留物,這對消費者的健康是有害的,這些年來,抗生素這種常規治療方法似乎顯得緩慢而不足[4]。因此,我們仍要努力尋找安全高效的藥物來防止奶牛乳腺炎,保證養殖業穩步發展,提高人民生活水平。
  
  1.1、奶牛乳腺炎病因。
  
  乳腺炎的發生因素極其復雜,包括入侵的病原體和宿主因素,如哺乳期、年齡、奶牛的免疫狀態、遺傳和營養狀況、動物本身的應激、環境因素、飼養管理等相互作用,而奶牛乳腺炎發生的主要因素是病原微生物的感染[5],臨床上現已分離鑒定出130余種可導致乳腺炎的致病菌[6]。傳染性致病菌多由擠奶操作不規范引起傳播,致病菌定植于乳腺上皮細胞或吞噬細胞中,引起無明顯癥狀的乳腺炎并逐漸發展成慢性乳腺炎[7],以大腸桿菌為主的環境性致病菌所引起的乳腺炎通常具有明顯的全身癥狀,這些致病菌通常隱藏在奶牛皮膚的褶皺中,通過開放的乳導管進入乳腺中繁殖,從生理和經濟角度看,細菌性乳腺炎是最常見和最重要的[2]。因此,對以下三種主要引起感染的病原菌作了簡單介紹。
  
  1.1.1、金黃色葡萄球菌。
  
  金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, S. aureus)為革蘭氏陽性兼性厭氧菌,可通過乳導管進入乳腺并爆發性感染,通常在6小時內就會引起乳區急性壞疽使乳腺壞死,嚴重可能導致敗血癥威脅生命[8]。因為其容易傳播,流行迅速,菌株變異快,善于逃避宿主免疫系統,除奶牛自身會感染發病外,金黃色葡萄球菌還會隨著乳汁分泌感染其他奶牛[9]。金黃色葡萄球菌菌體結構復雜,包括多種毒素和侵襲性酶,細菌在莢膜多糖的抗吞噬作用下不被吞噬細胞吞噬,利用粘附素在乳腺上皮細胞和吞噬細胞中定植,進一步產生毒素和酶破壞宿主細胞,使得感染難以控制[10]。另外,從公共衛生角度看,作為人獸共患菌,若乳制品含菌量超標,將嚴重影響人們的健康安全。
  
  1.1.2、大腸桿菌。
  
  大腸桿菌(Escherichia coli, E. coli)是革蘭氏陰性菌,在牛群里廣泛分布,該菌除從乳導管感染外,也會通過損傷的生殖道進入血循環或淋巴感染乳區[11],大腸桿菌釋放細菌細胞壁成分—脂多糖(LPS),誘導局部炎癥介質顯著增加,具有強烈的全身急性時相反應。越來越多的證據表明,LPS是最有效的觸發炎癥反應的微生物啟動者,通過乳腺上皮細胞凋亡來減少產奶量,并增加牛奶體細胞計數(SCC)。有研究表明[12],乳房內免疫反應可能是由革蘭氏陰性菌誘導的Toll樣受體(TLR)信號轉導引起。除了乳房炎的高炎癥反應外,持續或過度的炎癥還會誘導內皮細胞凋亡,可能導致組織損傷甚至死亡[13]。
  
  1.1.3、鏈球菌。
  
  鏈球菌有許多分類,其中以無乳鏈球菌為主要致病菌,無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae,GBS)革蘭染色呈陽性,是具有高度傳染性的專一乳腺內寄生菌,奶牛感染后通常無明顯臨床癥狀,一般不會引起乳腺組織纖維化或者膿腫,主要導致乳腺萎縮,表現為產奶量下降,牛奶中SCC升高[14]。
  

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  1、引言
  
  2、材料與方法

  
  2.1.1、動物
  2.1.2、儀器
  2.1.3、菌種
  2.1.4、試劑
  2.2、方法.
  2.2.1、腹腔注射鹽酸水蘇堿的急性毒性試驗
  2.2.2、鹽酸水蘇堿的體外抑菌試驗
  2.2.3、鹽酸水蘇堿對LPS誘導的小鼠乳腺炎的保護試驗
  2.2.4、統計學方法
  
  3、結果與分析
  
  3.1、急性毒性試驗.
  3.1.1、預試驗
  3.1.2、正式試驗
  3.2、體外抑菌試驗.
  3.3、小鼠乳腺大體解剖和病理組織學觀察
  3.4、鹽酸水蘇堿對MPO活性的影響
  3.5、鹽酸水蘇堿對促炎因子表達.影響
  3.6、鹽酸水蘇堿對氧化應激指標的影響
  
  4、討論
  
  4.1、急性毒性試驗.
  4.2、 鹽酸水蘇堿體外抑菌試驗
  4.3 、鹽酸水蘇堿對 LPS 誘導小鼠乳腺炎的保護作用

  5、  結 論

  5.1、腹腔注射鹽酸水蘇堿的LD50劑量為1565.442  mg/kg,其95%可信區間為1440.781~1711.356 mg/kg,說明鹽酸水蘇堿具有一定毒性。

  5.2、鹽酸水蘇堿在濃度為10 mg/kg時能抑制引起乳房炎的主要致病菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長,說明具有一定的抑菌活性。

  5.3、鹽酸水蘇堿能夠減輕乳腺的病理損傷,降低髓過氧化物酶活性,并通過抑制炎癥過度表達和提高抗氧化能力來預防LPS誘發的小鼠乳腺炎。

  參考文獻

作者單位:安徽農業大學
原文出處:張夢迪. 鹽酸水蘇堿對LPS誘發的小鼠乳腺炎的保護作用[D].安徽農業大學,2020.
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