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Viperin的生物學特性、表達調控及抗病毒作用

來源:動物醫學進展 作者:蘆冬,黃金海.
發布于:2021-03-24 共8292字

  摘    要: 病毒感染激活宿主細胞先天性免疫信號通路級聯反應,通過產生干擾素、抗病毒蛋白等來限制病毒復制和防止感染。Viperin是一種在物種間相對保守、參與先天性免疫的內質網相關抗病毒蛋白,通過與病毒蛋白、某些細胞內蛋白的相互作用調節信號轉導過程,發揮抑制多種病毒增殖的廣譜抗病毒作用。目前,對Viperin蛋白發揮抗病毒和免疫調節作用的功能域、作為自由基SAM酶家族成員發揮作用的機制有了新的認識,但對Viperin能夠在不同病毒感染細胞內發揮廣泛作用的確切機制仍不是很清楚。論文就Viperin的基本生物學特性、發揮不同抗病毒機制的研究進展進行綜述。

  關鍵詞: 抗病毒蛋白; Viperin; 宿主細胞蛋白; 相互作用;

  Abstract: Viral infection of the cell is able to initiate a signaling cascade of events that ultimately attempts to limit viral replication and prevent escalating infection through expression of interferons and antiviral proteins.Viperin is an endoplasmic reticulum ER-associated protein that is relatively conserved among species and participates in innate immunity.It regulates signal transduction through interaction with viral proteins and certain intracellular proteins,and exerts a wide range of inhibition on proliferation of various viruses,which is spectrum antiviral effect.At present,there is a new understanding of the functional domain of Viperin protein that exerts antiviral and immunomodulatory effects,and the mechanism of function as a member of the free radical SAM enzyme family,but the exact mechanism for Viperin to play a wide range of roles in different virus-infected cells is still unclear.This article reviewed the basic biological characteristics of Viperin and the research progress on different antiviral mechanisms.

  Keyword: antiviral protein; Viperin; host cell protein; interaction;

  地球上大多數生物都生存在微生物環境中,周邊環境中充斥著各種各樣的細菌與病毒,因此生物機體需要擁有完善的系統化的防御機制來抵抗細菌與病毒的侵擾,免疫系統在機體的防御機制中起到了重要作用。當病毒感染機體后,它會利用宿主的新陳代謝機制來完成病毒自身的復制與組裝,然后釋放到其他細胞當中[1]。機體自身的免疫系統通常分為先天性免疫病和獲得性免疫兩種。盡管殺傷性T細胞和產生抗體的B細胞在一段時間后可以對病原體產生適應性反應,但是先天性免疫對病毒感染能夠做出最快速的反應,它是機體抵抗病原體的第一道防線。
 

Viperin的生物學特性、表達調控及抗病毒作用
 

  病毒感染細胞能夠激發免疫信號級聯反應,通過釋放多種細胞因子,來限制病毒復制和防止感染的不斷升級。干擾素作為重要的細胞因子之一,能結合細胞表面特異性受體,誘導各種干擾素刺激基因(IFN-stimulated genes,ISG)的表達,它們大多數都具有抗病毒活性,因此又被稱為先天性免疫因子[2]。Viperin(Virus inhibitory protein,endoplasmic reticulum associated interferon inducible)便是其中的一員,研究發現宿主抗病毒蛋白Viperin在這個過程中發揮重要作用,它不僅具有限制多種病毒感染的能力,還表現出對Ⅰ型干擾素分泌的調節作用及調節許多轉錄因子的結合位點[3]。Viperin似乎具有調節細胞內狀態及干擾病毒蛋白,從而創造不利病毒復制的環境的能力[4]。本文對Viperin的生物學特性、亞細胞定位及表達調控、其抗病作用等方面的研究進展進行綜述。

  1先天性免疫與干擾素刺激基因

  機體發生病毒感染時,細胞可以通過模式識別受體(PRRs)識別入侵的病毒,激活細胞內多條信號通路并釋放多種細胞因子[5]。作為最為重要的細胞因子之一的干擾素(interferon,IFN),在抗病毒反應中發揮著關鍵作用[6]。有3種類型的干擾素,分別為Ⅰ型干擾素(IFN-α、β、ω、ε、κ)、Ⅱ型干擾素(IFN-γ)和Ⅲ型干擾素(IFN-λ1、λ2、λ3)[7]。在抗病毒免疫反應中,Ⅰ型干擾素是發揮作用的最主要干擾素,是病毒感染細胞,或者細胞受核酸、細菌內毒素和促細胞分裂素等物質刺激后,細胞內自身分泌的具有廣譜抗病毒活性的細胞因子[5]。

  Ⅰ型IFN包括由白細胞產生的IFN-α、由成纖維細胞合成的IFN-β、胎盤細胞合成的IFN-ε[8,9]、角質形成細胞合成的IFN-κ[9]、IFN-ω由白細胞產生并表現出與IFN-α類似的活性[9],IFN-τ和IFN-ζ由T和B淋巴細胞合成并分泌,但它們的功能仍不清楚。當病毒、細菌、真菌及寄生蟲感染人體后,細胞主要產生的Ⅰ型干擾素為IFN-α和IFN-β。

  IFN-α和IFN-β在調節先天免疫反應中有重要作用,特別是調節巨噬細胞和樹突細胞的功能[9]。此外,它們還影響適應性免疫應答,調節T淋巴細胞(主要是CD4+T和CD8+T細胞)的功能[9],影響Th淋巴細胞分化以及Tc、NK和B細胞的活化。同時,Ⅰ型IFN還影響細胞凋亡并促進炎癥反應的發生[9]。

  通過激活與病毒復制周期相互蛋白基因的轉錄,IFN-α和IFN-β可在感染和未感染的細胞以及旁觀者細胞中誘導抗病毒免疫來發揮多效性[9]。此外,IFN-β可以與IFN-α互相協調增強抗病毒效果,且其抗病毒活性強于IFN-γ[9]。

  當病毒入侵細胞后,會激活細胞內的多種信號通路,從而誘導干擾素的產生,Ⅰ型IFN產生后會與細胞表面的特異性受體結合,通過信號級聯反應激活下游300多種干擾素刺激基因(IFN-stimulated genes,ISG)的轉錄[10],其中有很多基因編碼產物都被發現能夠顯著限制病毒的復制,參與到多種抗病毒過程中,包括病毒抗原的呈遞、細胞凋亡以及病毒復制與組裝[11]。這些具有抗病毒活性的干擾素刺激基因編碼產物,又被稱為先天性免疫因子,隨著對宿主抗病毒反應機制的了解逐步增多,依然有大量的干擾素刺激基因未被發現和研究[12]。目前只對小部分干擾素刺激基因有了相關研究報道,例如蛋白激酶R(PKR),GTP酶MX1(抗黏病毒1),核糖核酸酶L(RNaseL),ISG15(IFN激活蛋白為15ku),IFIT(干擾素誘導蛋白與tetratricopeptide重復)、Viperin蛋白等[2]。

  2、Viperin的生物學特性

  Viperin全稱為與內質網相關聯的干擾素刺激的病毒抑制性蛋白,又稱為RSAD2(radical SAM domain-containing 2)或cig5(Cytomegalovirus inducible gene 5)。1997年首次在人類巨細胞病毒感染原代包皮成纖維細胞中得到了2個轉錄分析結果升高的片段,將這2個片段分別命名為cig5和cig33[13]。2001年,從經過IFN-γ誘導后的人巨噬細胞中克隆出一段cDNA序列,該段DNA序列包含一個由1 083個堿基組成的開放閱讀框,通過與之前發現的cig5、cig33進行比對后,發現它們具有極高的同源性,被命名為Viperin[14]。Viperin作為干擾素刺激基因被發現,在魚類、爬行動物及各種哺乳動物中廣泛存在[2]。

  Viperin基因含有1083個核苷酸,可編碼361個氨基酸[15],不同的物種間略有差異,整體保守性較高[16]。Viperin蛋白的大小約為42ku,大致由3個較為明顯的結構域組成[13]。N端的α螺旋結構域、C末端的保守結構域以及中間的S-腺苷甲硫氨酸酶結構域(SAM域)(圖1)。N端的1-42位氨基酸構成兩親性α螺旋結構,在14-42位氨基酸存在亮氨酸拉鏈結構,在不同物種中這一區域的序列差異性較大,能夠定位于細胞的內質網(endoplasmic reticulum,ER)表面和脂滴(lipid droplets)上[17]。中間部分從71到182位氨基酸含有4個相對保守的模塊(M1、M2、M3、M4),M1模塊中包含了保守的CxxxCxxC序列,能夠與鐵硫簇結合從而起到催化作用,為S-腺苷甲硫氨酸酶超家族,催化減少S-腺苷甲硫氨酸向5′脫氧腺苷的轉化。因此Viperin還有一個名稱為RSAD2[18]。雖然目前研究認為Viperin蛋白不具有特定的酶活性,但在Viperin發揮抗病毒功能時,如在對抗丙型肝炎病毒(HCV)和人巨細胞病毒(HCMV)的感染中,該模塊具有重要作用[7]。高度保守的C末端結構域大約由218-361位的氨基酸構成,目前關于該結構域的研究較少[13],已知其對于Viperin蛋白的二聚很重要,還可能介導底物與酶之間的識別以及蛋白與蛋白之間的互作相關。例如,在361位的氨基酸色氨酸殘基,被證明在抗HCV的感染當中是必要的[2]。

  圖1 Viperin蛋白結構圖
圖1 Viperin蛋白結構圖

  Fig.1 The protein structure of Viperin

  為了解不同物質間Viperin的同源性,將序列進行了比對,構建了系統進化樹。物種的Viperin序列從GenBank獲得,使用MEGA 5.0軟件的鄰接法產生無根系統樹,用1 000次重復進行分析。結果表明,人Viperin與猩猩Viperin(Pan troglodytes和Gorilla)具有較高的氨基酸序列同源性,但與家禽(Gallus gallus和Anas platyrhynchos)和魚類(Danio rerio和Cyprinus carpio)的同源性相對較低。豬Viperin與牛和綿羊有共同祖先(圖2)。

  3、Viperin的誘導表達及亞細胞定位

  Viperin通常在多種類型的正常健康細胞中較低水平自身表達,但是在干擾素、雙鏈DNA、雙鏈RNA、脂多糖以及Poly(I:C)刺激或者多種病毒的誘導下,Viperin的表達水平會顯著上升[19]。如圖3所示,Viperin的誘導表達包括兩條主要途徑。仙臺病毒、偽狂犬病病毒以及辛德畢斯病毒都能夠誘導干擾素刺激基因的產生。它們在進入宿主細胞后,首先被模式識別受體(PRRs),如Toll樣受體TLR3和TLR4,視黃酸誘導基因(RIG-Ⅰ)以及細胞溶質DNA傳感器識別,激活干擾素調節因子IRF3和IRF7,進而激活IFN-β的表達,產生的IFN-β通過自分泌或者旁分泌途徑結合到細胞表面的Ⅰ型干擾素受體,進而合成復合物ISGF3,結合到Viperin啟動子上從而激活Viperin的表達[20]。除此之外,還有一些病毒,例如水皰性口炎病毒、人巨細胞病毒,它們的病毒顆粒在進入細胞后,病毒的dsRNA會刺激RLRs,進而與線粒體抗病毒信號蛋白(MAVS)相互作用,從而激活IRF1和IRF3的產生,進而誘導Viperin的表達[19]。

  圖2 不同物種Viperin的系統進化樹
圖2 不同物種Viperin的系統進化樹

  Fig.2 Viperin phylogenetic tree of a range of species

  圖3 Viperin的誘導表達途徑
圖3 Viperin的誘導表達途徑

  Fig.3 Inducible expression pathway of Viperin

  有報道指出,Viperin可以形成同源二聚體,過表達之后會使內質網結晶化,形成格狀結構并破壞內質網本身的結構[13]。有人因此作出了一種假設模型,即Viperin通過C端結構域和N端的α螺旋結構域形成二聚體,介導內質網結晶化,形成一種獨特的結構[16]。已有研究表明,Viperin能夠定位在脂滴上,脂滴是一種起源于內質網的細胞器,能夠儲存蛋白質和脂質,參與到蛋白質的降解和脂質的運輸等過程當中。同時脂滴已經被證明是HCV和登革病毒(DENV)在細胞中的復制場所。Viperin N端的雙親性α螺旋結構能夠幫助Viperin錨定到脂滴上[13]。

  4 、Viperin的表達調控

  敲除掉Viperin基因的小鼠影響了其免疫反應,表現為細胞受體介導的NF-κB、AP-1的活性降低以及Th2反應的延遲。在其他使用人類單核樹突細胞的研究中,發現Viperin在Ⅱ型樹突細胞中的表達水平比在Ⅰ型樹突細胞中的更高,具有誘導原始T細胞向Th1和Th2細胞分化的能力。REIZIS B等報道了漿細胞樣樹突狀細胞(pDCs)中Viperin在Ⅰ型干擾素的產生中扮演了重要角色。pDCs是起源于骨髓的免疫細胞,能夠針對非自身核苷酸快速反應產生大量干擾素。pDCs有快速產生干擾素的能力主要是因為能夠持續性表達內源性的Toll樣受體TLR7和TLR9[21]。這2個受體分別能夠識別單鏈RNA和未甲基化的CpG DNA,IRF7則通過IRAK1和IKKα激活。與IRF1,IRF3一樣,IRF7也屬于干擾素轉錄調節因子家族。TLR7/9激活并結合到IRAK1和TRAF6后,Viperin可以被大量誘導表達,該過程涉及TLR信號通路。在pDCs中,Viperin的誘導對于經由TLR7/9產生Ⅰ型干擾素是必要的,Viperin基因缺失小鼠在TLR7/9刺激之后并不產生干擾素。Viperin蛋白N端的α螺旋對于Ⅰ型干擾素的產生很重要,不過并不與IRAK1和TRAF6相聯合,表明IRAK1和TRAF6的激活依賴于Viperin合適的亞細胞定位。Viperin對于IRAK1和TRAF6在脂滴中的招募是重要的,隨后才會激活IRF7。總之,在pDCs中,Viperin的誘導依賴于TLR7和TLR9信號通路,IRAK1和TRAF6又依賴Viperin招募到脂滴,之后IRF7被激活,從而誘導Ⅰ型干擾素的表達[22]。

  5、 Viperin的抗病毒作用

  目前已有報道顯示,Viperin在多種DNA病毒和RNA病毒中具有抗病毒功能,包括蟲媒病毒[丙型肝炎病毒(HCV),西尼羅河病毒(WNV),登革病毒(DENV)],甲病毒屬(辛德畢斯病毒),正黏病毒(甲型流感病毒),副黏病毒(仙臺病毒),皰疹病毒[人巨細胞病毒(HCMV)],棒狀病毒[水皰性口炎病毒(VSV)],逆轉錄病毒[人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)]等[23]。這些能夠被Viperin拮抗的病毒種類繁多,各自存在著不同的增殖機制,所以很難系統概括Viperin的抗病毒機制(表1)。

  表1 Viperin的抗病毒作用及關鍵結構域
表1 Viperin的抗病毒作用及關鍵結構域

  將辛德畢斯病毒和Viperin蛋白同時皮下注射給新生小鼠,同時設置只注射病毒的新生小鼠的對照組,結果顯示病毒的毒力出現了明顯下降。另有數據顯示,當將小鼠的viperin基因敲除掉后,小鼠會變得更加容易感染西尼羅病毒;在干擾了viperin基因表達的星形膠質細胞中,HIV-1的增殖水平明顯上升[24],表明Viperin可以在中樞神經系統的先天性免疫反應中發揮其特有的功能。

  在人類纖維母細胞中過表達Viperin后,病毒蛋白Gb、pp28、pp65的表達量明顯下降,首次證明了Viperin在HCMV感染中具有抗病毒功能[13]。Viperin通過阻止病毒顆粒的釋放來抑制甲型流感病毒和HIV-1的擴散。在HeLa細胞中過表達人類或鼠類的Viperin都展現出了對病毒出芽的抑制效果。Viperin還被發現能夠與法尼基二磷酸合酶FPPS結合,影響膽固醇和甾醇前體甲羥戊酸合成途徑,從而破壞了脂筏的結構,增加了膜的流動性。同時,在HEK293細胞中,Viperin能夠利用它的SAM結構域抑制HIV-1的釋放[24]。

  Viperin能夠抑制HCV的非結構蛋白NS5A的表達,阻止其復合體在脂滴的形成,從而抑制HCV增殖[25]。Viperin的C端結構域能夠與DENV的NS3蛋白結合互作,這一過程雖然并不定位在脂滴上,但依然能夠發揮抑制病毒增殖的作用[26]。Viperin的SAM域的酶活性能夠抑制TBEV的RNA的合成,從而起到對該病毒的抑制作用[27]。Viperin的α螺旋結構域不僅能抑制囊膜蛋白的表達,破壞內質網結構,阻礙病毒顆粒的組裝,還能通過抑制馬傳染性貧血病毒(EIAV)受體的表達,從而阻止病毒的入胞[28]。

  總之,Viperin的廣譜性抗病毒活性已被證實(圖4),在不同病毒感染中的作用靶點以及機制等仍需要進一步探索。

  圖4 Viperin的部分抗病毒功能[29]
圖4 Viperin的部分抗病毒功能[29]

  Fig.4 Partial antiviral functions of Viperin

  6、 展望

  根據生物進化的“紅皇后假說”,Viperin在宿主與病毒的長期相互作用中,在哺乳動物和低等脊椎動物中高度保守,特別是Viperin的SAM結構域和C端在發揮抗病毒作用的同時,還表現出了高度保守性[13],說明在物種進化過程中,該蛋白在與多種病毒相互作用的壓力下,仍然保持了其結構與功能的穩定性,可以推測Viperin可能存在更多的潛在生物學功能。自2001年作為一種干擾素刺激基因被發現及其被鑒定為是對HCMV有效的宿主抗病毒蛋白以來,對于Viperin的生物化學和細胞生物學特性的了解正在逐步加深,但在很大程度上,它的精確作用機制仍然尚未定義。不同病毒在其復制周期中會采用不同的復制機制并利用不同的細胞器來完成復制,針對不同的病毒,Viperin會以不同的方式來抑制病毒的復制,同時它還具有調節先天性免疫信號的能力,但這其中仍然存在很多問題,例如Viperin在未感染細胞中是否具有其他功能?Viperin與內質網、脂滴或線粒體相關的生物學作用是什么?由于有很多病毒可以不通過產生干擾素而直接誘導Viperin的產生,因此可以推測病毒是否會通過劫持Viperin來增加該病毒的感染性,針對這些問題的研究所獲得的信息將有助于進一步闡明Viperin的生化特性和抗病毒活性,這對于Viperin在抗病毒及先天性免疫中所扮演角色的認識具有重要意義。

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作者單位:天津大學生命科學學院
原文出處:蘆冬,黃金海.Viperin在抗病毒免疫中的作用研究進展[J].動物醫學進展,2020,41(05):90-95.
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